Учебная работа. Исследование биологических объектов с помощью методов атомно-силовой микроскопии

1 Звезда2 Звезды3 Звезды4 Звезды5 Звезд (Пока оценок нет)
Загрузка...

исследование биологических объектов с помощью методов атомно-силовой микроскопии

Министерство образования и науки российской Федерации.

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Чувашский государственный педагогический университет им. И. Я. Яковлева»

Физико-математический факультет

Кафедра общей и теоретической физики

Курсовая работа

по дисциплине физика

на тему

«исследование биологических объектов с помощью методов атомно-силовой микроскопии»

Работа выполнена

студентом IV курса физико-математического факультета

очной формы обучения

специальности «Физика и информатика»

Сергеевым Станиславом Андреевичем

Научный руководитель

Алексеева Наталья Сергеевна.

Чебоксары, 2013 г.

Введение

Актуальность данной работы состоит в том, что применение сканирующего туннельного микроскопа имеет ряд проблем, которые решаются методами атомно-силовой микроскопии. Также с помощью АСМ возможна доставка лекарственных препаратов в пораженные раком клетки.

Первый промышленный АСМ был изготовлен в США фирмой Диджитал инструментс (Digital Instruments) в 1989 году. сегодня в различных лабораториях имеется более 1000 таких приборов, в России — около 60. Атомный силовой микроскоп позволяет наблюдать рельеф поверхности с большим пространственным разрешением — несколько ангстрем вдоль поверхности и сотые доли ангстрема по высоте (1 ангстрем = 1 Å = 10-8 см). При таком разрешении удается увидеть отдельные молекулы, составляющие твердое тело. первая работа, в которой с помощью АСМ изучался рост кристалла в растворе, опубликована в 1992 году. Так началась новая эра экспериментального исследования физики кристаллизации, эра изучения элементарных актов присоединения частиц к растущей поверхности.

1.Сканирующий туннельный микроскоп

В 1982 году два швейцарских физика Герд Бинниг и Гейнрих Рорер, работающие в Исследовательской лаборатории фирмы ИБМ в Цюрихе (Швейцария), сконструировали прибор совершенно нового типа, с помощью которого можно было рассматривать отдельные атомы на поверхности. Создателям этого прибора — сканирующего туннельного микроскопа — в 1986 году была присуждена Нобелевская премия.

Туннельным эффектом называется возможность элементарной частице, Например электрону, пройти (протуннелировать) через потенциальный барьер, когда энергия барьера выше полной энергии частицы. Возможность существования туннельного эффекта в микромире была понята физиками в период создания квантовой механики, в 20-30-х годах нашего века. В дальнейшем за счёт туннельного эффекта были объяснены некоторые весьма важные явления, обнаруженные экспериментально в различных областях физики. Принцип действия сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) довольно прост, но кардинально отличается от всех предшествующих методик, применявшихся в физике поверхности. Тонкое металлическое острие, смонтированное на электромеханическом приводе (X, Y, Z-позиционере), служит зондом для исследования участков поверхности образца. Когда такое острие подводится к поверхности на расстояние , то при приложении между острием и образцом небольшого (от 0,01 до 10 В) напряжения смещения через вакуумный промежуток начинает протекать туннельный <#"justify">Экспоненциальная зависимость туннельного тока от расстояния позволяет осуществлять регулирование расстояния между зондом и образцом в туннельном микроскопе с высокой точностью. СТМ представляет собой электромеханическую систему с отрицательной обратной связью. Система обратной связи поддерживает величину туннельного тока между зондом и образцом на заданном уровне, выбираемом оператором. Контроль величины туннельного тока, а следовательно, и расстояния зонд-поверхность осуществляется посредством перемещения зонда вдоль оси Z с помощью пьезоэлектрического элемента. Изображение рельефа поверхности в СТМ формируется двумя методами. По методу постоянного туннельного тока зонд перемещается вдоль поверхности, осуществляя растровое сканирование; при этом изменение напряжения на Z — электроде пьезоэлемента в цепи обратной связи (с большой точностью повторяющее рельеф поверхности образца) записывается в память компьютера в виде функции Z = f (x,y), а затем воспроизводится средствами компьютерной графики.

При исследовании атомарно гладких поверхностей часто более эффективным оказывается получение СТМ изображения поверхности по методу постоянной высоты Z = const. В этом случае зонд перемещается над поверхностью на расстоянии нескольких ангстрем, при этом изменения туннельного тока регистрируются в качестве СТМ изображения поверхности (рис.1).

Рис.1. Формирование СТМ изображений поверхности по методу постоянного туннельного тока (а) и постоянного среднего расстояния (б).

Сканирование производится либо при отключенной ОС, либо со скоростями, превышающими скорость реакции ОС, так что ОС отрабатывает только плавные изменения рельефа поверхности. В данном способе реализуются очень высокие скорости сканирования и высокая частота получения СТМ изображений, что позволяет вести наблюдение за изменениями, происходящими на поверхности, практически в реальном времени. Высокое пространственное разрешение СТМ определяется экспоненциальной зависимостью туннельного тока от расстояния до поверхности. Разрешение в направлении по нормали к поверхности достигает долей ангстрема. Латеральное же разрешение зависит от качества зонда и определяется, в основном, не макроскопическим радиусом кривизны кончика острия, а его атомарной структурой.

При правильной подготовке зонда на его кончике с большой вероятностью находится либо одиночный выступающий атом, либо небольшой кластер атомов, который локализует его на размерах, много меньших, чем характерный радиус кривизны острия. действительно, туннельный ток протекает между поверхностными атомами образца и атомами зонда. Атом, выступающий над поверхностью зонда, находится ближе к поверхности на расстояние, равное величине периода кристаллической решетки.

Поскольку зависимость туннельного тока от расстояния экспоненциальная, то ток в этом случае течет, в основном, между поверхностью образца и выступающим атомом на кончике зонда.

Исследователи всего мира, занимающиеся физикой поверхности, да и вообще физикой конденсированных сред, немедленно убедились, что туннельный микроскоп — прибор совершенно замечательный. Действительно, ведь до его появления еще никому не удавалось разглядывать поверхность с такой неслыханной детальностью — атом за атомом. однако у СТМ есть один недостаток: с его помощью можно изучать только материалы, хорошо проводящие электрический ток. Такое ограничение вытекает из самого принципа работы СТМ — для эффективного туннелирования (просачивания) электронов через зазор между поверхностью исследуемого образца и чувствительным элементом прибора (иглой) на поверхности должно быть много, как говорят физики, электронных состояний. поэтому когда исследователи принялись изучать с помощью СТМ непроводящие вещества, они были вынуждены покрывать такие вещества металлической пленкой либо «пришивать» их к поверхности проводника, например золота.

2.Атомно-силовой микроскоп

Но вот в конце 1986 года тот же Бинниг предложил конструкцию прибора нового поколения, который тоже позволяет исследовать поверхности с беспрецедентной детальностью, но уже вовсе не обязательно электропроводящие. Новый прибор был назван атомным силовым микроскопом, и сегодня именно он представляет наибольший интерес для исследователей. В основе работы АСМ лежит силовое взаимодействие между зондом и поверхностью, для регистрации которого используются специальные зондовые датчики, представляющие собой упругую консоль с острым зондом на конце (рис. 2). Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Регистрируя величину изгиба, можно контролировать силу взаимодействия зонда с поверхностью.

Рис.2. Схематическое изображение зондового датчика АСМ

качественно работу АСМ можно пояснить на примере сил Ван-дер-Ваальса. Наиболее часто энергию Ван-дер-Ваальсова взаимодействия двух атомов, находящихся на расстоянии r друг от друга, аппроксимируют степенной функцией — потенциалом Леннарда-Джонса

первое слагаемое в данном выражении описывает дальнодействующее притяжение, обусловленное, в основном, диполь- дипольным взаимодействием атомов. второе слагаемое учитывает отталкивание атомов на малых расстояниях. Параметр r — равновесное расстояние между атомами, U0 — значение энергии в минимуме.

Рис. 3. качественный вид потенциала Леннарда — Джонса

Потенциал Леннарда-Джонса позволяет оценить силу взаимодействия зонда с образцом. Общую энергию системы можно получить, суммируя элементарные взаимодействия для каждого из атомов зонда и образца.

Рис. 4. К расчету энергии взаимодействия зонда и образца.

Тогда для энергии взаимодействия получаем:

где ns (r) и np (r’) — плотности атомов в материале образца и зонда. Соответственно сила, действующая на зонд со стороны поверхности, может быть вычислена следующим образом:

В общем случае данная сила имеет как нормальную к поверхности, так и латеральную (лежащую в плоскости поверхности образца) составляющие. Реальное взаимодействие зонда с образцом имеет более сложный характер, однако основные черты данного взаимодействия сохраняются — зонд АСМ испытывает притяжение со стороны образца на больших расстояниях и отталкивание на малых. Получение АСМ изображений рельефа поверхности связано с регистрацией малых изгибов упругой консоли зондового датчика. В атомно-силовой микроскопии для этой цели широко используются оптические методы (рис. 4).

Рис. 5. Схема оптической регистрации изгиба консоли зондового датчика АСМ

Оптическая система АСМ юстируется таким образом, чтобы излучение полупроводникового лазера фокусировалось на консоли зондового датчика, а отраженный пучок попадал в центр фоточувствительной области фотоприемника. В качестве позиционно — чувствительных фотоприемников применяются четырехсекционные полупроводниковые фотодиоды.

Рис. 6. Соответствие между типом изгибных деформаций консоли зондового датчика и изменением положения пятна засветки на фотодиод

основные регистрируемые оптической системой параметры — это деформации изгиба консоли под действием Z-компонент сил притяжения или отталкивания (FZ) и деформации кручения консоли под действием латеральных компонент сил (FL) взаимодействия зонда с поверхностью. Если обозначить исходные значения фототока в секциях фотодиода через I01, I02, I03, I04, а через I1, I2, I3, I4 — значения токов после изменения положения консоли, то разностные токи с различных секций фотодиода ΔIi = Ii — I0i будут однозначно характеризовать величину и направление изгиба консоли зондового датчика АСМ. действительно, разность токов вида:

пропорциональна изгибу консоли под действием силы, действующей по нормали к поверхности образца.

А комбинация разностных токов вида характеризует изгиб консоли под действием латеральных сил.

Величина ΔIZ используется в качестве входного параметра в петле обратной связи атомно-силового микроскопа (рис.7). Система обратной связи (ОС) обеспечивает ∆IZ = const с помощью пьезоэлектрического исполнительного элемента, который поддерживает изгиб консоли ΔZ равным величине ΔZ0 , задаваемой оператором.

Рис.7. упрощенная схема организации обратной связи в атомно-силовом микроскопе

При сканировании образца в режиме ΔZ = const зонд перемещается вдоль поверхности, при этом напряжение на Z-электроде сканера записывается в память компьютера в качестве рельефа поверхности Z = f(x,y). Пространственное разрешение АСМ определяется радиусом закругления зонда и чувствительностью системы, регистрирующей отклонения консоли. В настоящее время реализованы конструкции АСМ, позволяющие получать атомарное разрешение при исследовании поверхности образцов.

То есть принцип действия атомного силового микроскопа основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества.

Рис. 8

На малых расстояниях между двумя атомами (около одного ангстрема, 1 Ǻ = 10-8 см) действуют силы отталкивания, а на больших — силы притяжения. Совершенно аналогичные силы действуют и между любыми сближающимися телами. В сканирующем атомном силовом микроскопе такими телами служат исследуемая поверхность и скользящее над нею острие. Обычно в приборе используется алмазная игла, которая плавно скользит над поверхностью образца (как говорят, сканирует эту поверхность). При изменении силы F, действующей между поверхностью и острием, пружинка П, на которой оно закреплено, отклоняется, и такое отклонение регистрируется датчиком D. В качестве датчика в АСМ могут использоваться любые особо точные и чувствительные — прецизионные — измерители перемещений, например оптические, емкостные или туннельные датчики. фактически это такая же игла, какая применяется в сканирующем туннельном микроскопе.

Величина отклонения упругого элемента (пружинки) несет информацию о высоте рельефа — топографии поверхности и, кроме того, об особенностях межатомных взаимодействий. Можно сказать, что в атомном силовом микроскопе сканирование исследуемого образца происходит по «поверхности постоянной силы».

Применение АСМ:

·Получение трехмерных изображений исследуемых объектов с пространственным разрешением до атомарного и молекулярного.

·Нанометрия — исследование с нанометровым разрешением шероховатости поверхности образца.

·исследование биологических объектов — макромолекул (в том числе и молекул ДНК), вирусов и других биологических структур.

·Широкие перспективы в области материаловедения — при изучении микро-, суб- и кристаллических структур различных материалов.

·Перемещение отдельных атомов, выстраивание сложных квантовых структур.

·Возможность исследовать объекты в жидкой среде.

·Высокая пространственная точность и локализация воздействия в методе силовой нанолитографии.

3.Исследования биологических объектов с помощью АСМ

Новаторская научная команда IBM в Цюрихе опубликовала изображения молекул, которые настолько совершенны, что на них можно увидеть атомные связи между отдельными атомами.

Эта же команда сделала первое в мире фото отдельной молекулы в 2009 году, а позднее опубликовала фото молекул в форме Олимпийских колец.

Это новая работа позволит начать исследование недостатков в «чудо-материале» графене или отследить движение электронов в ходе химических реакций.

В 2004 году в японии исследователи из Национального института науки и техники (JAIST) превратили атомный силовой микроскоп в хирургический инструмент, с помощью которого можно прооперировать одну единственную клетку, не нанеся ей никаких повреждений. Они использовали луч ионов, чтобы заострить стандартный кремниевый наконечник силового микроскопа, превратив его в иглу длиной 8 микрометров и шириной 200 нанометров.

Микроскоп может «ощутить» силу, приложенную к клетке, что делает его чрезвычайно отзывчивым и точным инструментом. Когда учёные вставили новую иглу в человеческую эмбриональную клетку, на стенке клетки остался «прокол» всего в 1 микрометр. Мембрана клетки быстро вернулась в первоначальную форму, а игла была продвинута в ядро клетки.

Исследователи утверждают, что с такой точностью твердый материал был вставлен в ядро живой клетки впервые. Новая технология позволит вводить молекулы в определённые области клеток, например, цепочки ДНК могли бы быть вставлены непосредственно в ядро, чтобы проверить новые методы для снятия или устранения симптомов и проявлений заболевания»>терапии гена. Кроме того, АСМ позволит наблюдать за локальным действием вводимых в клетки фармакологических препаратов в режиме реального времени.

В 2005 году специалисты из Ливерморской национальной лаборатории и Университета Калифорнии в Дэвисе научились непосредственно измерять силу связи между белковыми молекулами. Эта техника может стать существенным подспорьем в разработке методов целевой доставки лекарственных препаратов в пораженные раком клетки.

Одна из важнейших задач, решаемых при разработке новых лекарств, доставка действующего вещества в нужные клетки организма. Для этого вещество должно эффективно взаимодействовать с пептидами на поверхности клетки. однако до сих пор это взаимодействие изучалось, как правило, косвенными методами: сначала на компьютерных моделях молекул, затем — по эффективности воздействия на реальные живые организмы.

Теперь появилась возможность прямых измерений сил молекулярного взаимодействия. К игле (зонду) которого прикрепили несколько фрагментов антител, игравших роль молекул действующего лекарственного вещества. Зонд подносили к поверхности, покрытой пептидом MUC1, разные формы которого являются характерными маркерами различных видов рака, то есть присутствуют на поверхности пораженных клеток. По изгибу консоли, несущей зонд, удалось количественно оценить силу связи между молекулами.

Такой подход может значительно ускорить разработку новых лекарств.

После того как новое вещество спроектировано на компьютере и синтезировано в лаборатории, можно сразу измерить, насколько хорошо оно взаимодействует с целевыми рецепторами, и при необходимости внести изменения в состав и строение молекул. Принципиальным является то, что измерять силу связи молекул физическим методом гораздо проще, чем каждый раз повторять испытания на живых культурах и организмах.

Рис.9. Трехмерные АСМ-изображения кардиомиоцитов, осажденные на поверхности стекла при разной степени диссоциации

На рис.9. Приведены экспериментальные сканы клеток миокарда крысы. Как видно из сканов, увеличивая степень диссоциации, удается получить одиночные клетки разнообразной формы с характерными параметрами 1,5-2 мкм в длину и 50-11 нм в высоту, что выявлено при построении профиля одиночной клетки. Таким образом, АСМ позволяет нам оценить многие параметры клеток миокарда, такие как длина, ширина, высота, площадь, средние значения шероховатости и другие, что открывает широкие возможности в изучении механизмов многих биологических процессов (рост, деление, апоптоз).

Исследованию клеток крови — лейкоцитов и эритроцитов методом атомно-силовой микроскопии. несмотря на огромное разнообразие методов диагностики клеток крови, атомно-силовая микроскопия представляет собой самый современный инструмент для проведения исследований. АСМ позволяет измерять не только профиль поверхности, но и локальные силы трения, величину адгезии, упругие и вязкие свойства поверхности с субнанометровым пространственным разрешением.

Приготовление препаратов для исследований с помощью атомно-силовой микроскопии позволяет избежать жесткой фиксации образцов и методов обработки солями тяжелых металлов, которые традиционно применяются в световой и электронной микроскопии. Подобные процедуры зачастую не соответствуют природным условиям, в которых макромолекулы проявляют свою биологическую активность. высокое разрешение порядка нескольких нанометров, относительно небольшое время — минуты, которое требуется для сканирования, отсутствие необходимости вводить метки и фиксировать образец делают АСМ одним из удобных инструментов исследований в биологии.

Рис.10. Изображение лейкоцита

Проводилось измерение линейных параметров лимфоцита. Справа — силовая кривая, вершина графика соответствует максимальной высоте клетки (высота ядра, т.к. клетка распластана). По силовой кривой можно рассчитать вязко-упругие свойства мембраны изучаемой клетки.

В результате проведенного исследования разработан наиболее адекватный способ приготовления клеток крови эритроцитов и лейкоцитов для дальнейшего исследования структурно-функциональных и вязко-упругих свойств поверхностной мембраны клеток крови в норме и при патологии.

эксперты отмечают, что платформа «Бионаноскопия» (в которую входим СЗМ) призвана обеспечивать эффективный молекулярный анализ биологического материала человека как с целью назначения адекватного курса лечения, так и предотвращения возможных заболеваний. Возможно применение разрабатываемой платформы для анализа структуры человеческого волоса, что относится к трихологии — науке о волосах (рис.11).

Рис. 11. Структуры: (а) нормального волоса, (б) волоса с патологией

Вставка на рис. слева — перепад высот между чешуйками (кутикулой) здорового волоса, по данным АСМ составляющий 380 нм

Рис. 12. Трехмерное изображение эритроцитов

Рис. 13. Изображение одиночной бактерии E. coli JM109, осажденной на поверхность слюды

Размер изображения 3´ 2,5 мкм2. Изображение получено с помощью атомно-силового микроскопа в режиме постоянной силы. Для оттенения мелких деталей при построении изображения применена боковая подсветка.

Рис.14. Изображение одиночной бактерии E.coli штамма HB101

Изображение получено в режиме постоянной высоты. Размер кадра 2,8´ 2,5 мкм2. Для оттенения мелких деталей применена боковая подсветка.

Выводы

Атомный силовой микроскоп может использоваться для определения микрорельефа поверхности, с его помощью можно наблюдать всевозможные несовершенства структуры, локализованные на изучаемых поверхностях, например, дислокации или заряженные дефекты, а также всяческие примеси. кроме того, АСМ позволяет выявить границы различных блоков в кристалле, в частности доменов. Интересно, что АСМ позволяет решать не только прикладные задачи, но и глобальные проблемы фундаментальной физики. В частности, определив с его помощью поверхности и острия, можно сделать довольно точные заключения о существовании или отсутствии новых фундаментальных взаимодействий и даже о структуре физического вакуума.

В последнее время с помощью атомного силового микроскопа физики стали интенсивно изучать биологические объекты, например молекулы ДНК и другие макромолекулы, главным образом для целей нарождающегося и, судя по всему, чрезвычайно перспективного направления — биомолекулярной технологии. Развитие и внедрение технологии измерения механических свойств клеток с помощью АСМ в медицинскую практику может принести огромную пользу врачам при диагностике рака и выборе вариантов лечения.

атомный микроскоп молекула вирус

Список литературы

·В. Л. Миронов. основы сканирующей зондовой микроскопии / Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений. российская академия наук, Институт физики микроструктур. Нижний Новгород, 2004 — 110 с.

· Г. А. Желтухина, Т. Н. Лобанова, В. Е. Небольсин, И. А. Костанян, С. М. Драницына, М. О. Галлямов, А. Р. Хохлов, Взаимодействие искусственной нуклеазы и ДНК: данные атомно-силовой микроскопии // Доклады Академии Наук (2005), т. 405(5), сс. 630-633.

·Ю.М. Ефремов, Д.В. Багров, Е.В. Дубровин, К.В. Шайтан, И.В. Яминский. Атомно-силовая микроскопия животных клеток: обзор достижений и перспективы развития // Биофизика, № 56 (2011) 288-303.

·И.В. Яминский. Д.В. Багров. основы атомно-силовой микроскопии // Учебно-методический комплекс для бакалавров. М.:НОУДПО «Институт Ай-Ти, 2011. — 128 с.

Учебная работа. Исследование биологических объектов с помощью методов атомно-силовой микроскопии